Главная страница «Первого сентября»Главная страница журнала «Биология»Содержание №47/2000

ДЕТСКИЕ РАБОТЫ

И.Ю. КУДИНОВА,
В.А. КРАТАСЮК,
Красноярский государственный университет,
Институт биофизики СО РАН, г. Красноярск

Да здравствует мыло... мягкобактерицидное!

Исследование действия мыла на бактерии биолюминесцентным методом

Современная биология характеризуется трудоемкими, сложными и дорогостоящими методами, которые невозможно использовать в школьном образовании. Однако существуют исключения.
К ним относятся биолюминесцентные методы. Возможно, в будущем они будут широко использоваться в школьных лабораториях.В экспериментальной школе №106 «Универс» Красноярска осенью 1999 г. была создана учебно-научная экологическая лаборатория и проводился биолюминесцентный практикум с использованием светящихся бактерий.
На одном из занятий в лаборатории мы раздали учащимся пузырьки со светящимися бактериями и предложили самостоятельно провести с ними какие-нибудь эксперименты. На следующем занятии оказалось, что бактерии подверглись самым разным воздействиям: облучению, охлаждению, нагреванию, действию самых разных веществ. Как оказалось, большинство учащихся исследовали действие различных моющих средств на свечение бактерий. Один из них вскоре отважился на более серьезную работу – исследование механизма действия моющих средств на бактерии.
Цель данной публикации – дать пример творческого исследования школьника с использованием биолюминесцентных систем. Это позволит читателю получить конкретное представление о биолюминесценции и использовании биолюминесцентных методик.
Мы используем огромное количество моющих средств. Грязная вода после этого сливается в миллионы канализационных труб и попадает в близлежащие реки и озера. Иногда она проходит предварительную очистку, иногда нет. Даже если сточные воды прошли очистку, некоторые их компоненты не разрушаются.
Попав в водоем, они могут нарушить в нем экологическое равновесие. В связи с этим необходимы быстрые методы определения биологического действия сточных вод.
В последнее время широкое распространение получили биотесты на основе бактериальной биолюминесценции. Биолюминесцентное тестирование относится к интегральным способам определения токсичности, которые позволяют выявлять не отдельные вредные вещества, а их общебиологическое действие и одновременно оценивать возможные эффекты их взаимоусиления или ослабления.
Впервые биотест с использованием биолюминесцентных бактерий был применен в 1963 г. В 1980 г. этот метод был стандартизирован в Германии как способ обнаружения загрязнений. Позже этот метод модифицировался различными исследователями.
В 1990 г. для биотестирования было предложено использовать водорастворимые ферментативные биолюминесцентные системы (in vitro).
Биолюминесцентные системы (in vitro и in vivo) одновременно использовались для мониторинга сточных вод и природных водоемов Алтайского и Красноярского краев, а также искусственных водных экосистем.
Опыт использования биолюминесцентных систем показал, что в ряде случаев они обладают различной чувствительностью к токсикантам. Поэтому для их практического использования необходимо сравнение их чувствительности к различным классам химических соединений.
Один из способов изучения биолюминесцентных систем, используемых в качестве биотестов, – исследование изменений их кинетических параметров под действием соединений различных химических классов с известными свойствами.
Цель данной работы: исследование действия растворов моющих средств на две биолюминесцентные системы различной сложности – светящиеся бактерии Photobacterium phosphoreum и водорастворимую биферментную систему
NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза, а также выявление связи между результатами биолюминесцентного анализа и влиянием моющих средств на поверхностное натяжение.

Глава I. Обзор литературы

1.1. Бактериальная биолюминесценция

Биолюминесцения – это свечение живых организмов. Светящиеся бактерии – единственные светящиеся организмы, используемые в измерительных системах биотестирования токсичности. Бактериальная биолюминесценция представляет собой процесс окисления субстрата (люциферина) в присутствии специфического фермента (люциферазы).

FMN+NADH --> FMNH2 +NAD+

FMNH22+RCOO --> RCOOH +FMN + H2О + hv

Биолюминесцентный сигнал представляет собой последовательность импульсных сигналов, следующих с частотой около 0,02 Гц, а каждый пакет состоит из 5–10 хорошо сформированных импульсов, следующих с частотой около 1 Гц. В течение одного импульса высвечивается 10 фотонов. В отличие от интенсивности свечения, спектр бактериальной биолюминесценции не зависит от внешних условий.

В работе использована культура бактерий Photobacterium phosphoreum, которые представляют собой короткие палочки, или коккобациллы, с размерами (1–2,5)x(0,4–1) мкм. Они подвижны благодаря наличию одного жгутика или целого пучка полярных жгутиков и относятся к хемоорганотрофам. Аэробы. оптимальная температура 20–30 °С. Растут при концентрациях NaCl от 0,5 до 5% (без NaCl не растут) и рН 6,0–9,0. Оптимальной является концентрация NaCl 3%. Спектр свечения лежит в области 420–600 нм с максимумом 472 нм.

1.2. Как моет мыло?

Основным компонентом моющих средств являются поверхностно-активные вещества (ПАВ). Действие ПАВ основано на изменении поверхностного натяжения на границе раздела фаз. Поверхностное натяжение характеризуется силой, которая действует вдоль поверхности жидкости перпендикулярно к силе, ограничивающей эту поверхность, и стремится сократить ее до минимума. Причиной возникновения поверхностного натяжения является нескомпенсированность межмолекулярных сил на границе раздела фаз.

Сырьем для получения ПАВ служат жирные кислоты (растительные и животные), нефтяные парафины и т.д. Кроме ПАВ моющие средства содержат еще множество компонентов (загустители, отдушки, бактерицидные вещества и т.д.). В качестве бактерицидных веществ в моющие средства могут входить растительные экстракты, этанол, галогенированные производные фенолов, дифенилового эфира и т.д.

Глава II. Материалы и методы

2.1. Измерение биолюминесценции светящихся бактерий

В работе использованы наборы кювет, микропипетки емкостью от 5 мкл до 1 мл, флаконы емкостью 5–10 мл, весы аналитические ВЛР-200 (II класс ГОСТ 19491–74) и другое лабораторное оборудование. Для регистрации биолюминесценции использованы биолюминометр БЛМ 8804, изготовленный в Институте биофизики СО РАН, и самописец 2210 («LKB», Швеция). При анализе действия исследуемой группы соединений на биолюминесценцию светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum использовали лимфилизированный препарат бактерий «Микробиосенсор B-1760F», разработанный и изготовленный в Институте биофизики СОРАН. В работе использовали следующие свежеприготовленные растворы: к флакону препарата бактерий добавляли 2 мл 1,5%-ного раствора NaCl, растворы моющих средств с концентрацией 10 мг/мл готовили на 3%-ном растворе NCl. Концентрация С(х) моющих средств в исследуемых растворах составляла 10–2 мг/мл.

Эффективность воздействия характеризовали бактериальным индексом (БИ):

БИ = I0/Ik, где I0 – интенсивность свечения опытной кюветы, Ik – интенсивность свечения контрольной кюветы.

2.2 Биферментная система

В работе использовали свежеприготовленные растворы NADH (4 мМ) и FMN (4 мМ); для получения 0,002%-ного раствора тетрадеканаля 50 мкл 0,2%-ного раствора тетрадеканаля тщательно размешивали в 5 мл фосфатного буфера (рН 6,8–7,0). Во флакон реагента NADH-КРАБ (комплект реактивов аналитической биолюминесценции), который содержал 0,11 мг люциферазы и 0,069 ед. активности NАDH:FМN-оксидоредуктазы, вносили 500 мкл 0,02 М фосфатного буфера. Раствор хранили на льду.

Измерение биолюминесценции проводили следующим образом. В кювету биолюминометра вносили последовательно:

  • 5 мкл раствора КРАБ;

  • 50 мкл 0,002%-ного раствора тетрадеканаля;

  • 200 мкл 0,02 М фосфатного буфера или раствор исследуемого вещества;

  • 200 мкл 0,4 мМ раствора NADH;

  • 50 мкл 0,4 мМ раствора FMN.

Эффективность воздействия характеризовали люциферазным индексом (ЛИ):

ЛИ = I0/Ik, где I0 – интенсивность свечения опытной кюветы, Ik – интенсивность свечения контрольной кюветы.

2.3. Измерение поверхностного натяжения

В работе использованы мерные колбы на 20 мл, рамка из тонкой проволоки, весы чашечные, песок, штангенциркуль, емкости с водой. Поверхностное натяжение было рассчитано по формуле:

d = mg/2l, где d – коэффициент поверхностного натяжения, g – ускорение свободного падения, m – средняя масса песка при отрыве рамки от поверхности воды, l – длина рамки.

Глава III. Результаты и обсуждение

3.1. Действие моющих средств на биолюминесценцию

Результаты измерений изменения интенсивности люминесценции биферментной системы и бактерий Photobacterium phosphoreum под действием моющих средств представлены на рис. 1.

Рис. 1. Влияние моющих средств на интенсивность биолюминесценции бактерий (БИ) и (ЛИ)

Рис. 1. Влияние моющих средств на интенсивность биолюминесценции бактерий (БИ) и (ЛИ). Мыло: 1 – «детское»; 2 – турецкого производства; 3 – «Saveguard»; 4 – «витаминизированное» (ф-ка «Свобода»); 5 – «мягкобактерицидное» (ф-ка «Свобода»); 9 – «хозяйственное». Порошки: 6 – «Лоск», 7 – «Tide»; 8 – «Эрго». Моющее средство: 10 – «Fairy»

Анализ полученных результатов проводили в рядах мыл и порошков. Как видно из рис. 1, наименьшее действие на свечение бактерий оказывает «детское» мыло (1). Среди исследованных моющих средств оно характеризуется наименьшим значением БИ, следовательно, характеризуется наименьшим бактерицидным действием. В то же время «мягко бактерицидное» мыло (5) ф-ки «Свобода» при той же концентрации (10–2 мг/мл) полностью ингибирует свечение бактерий, что свидетельствует о наличии в его составе активных бактерицидных веществ. Наличием бактерицидных веществ изначально характеризуется и мыло «Saveguard» (3), однако, действие его на биолюминесценцию бактерий значительно меньше, чем мыла (5), что, вероятно, связано с иным химическим составом и меньшей концентрацией в нем бактерицидных веществ.

Среди исследованных средств для стирки белья максимальное воздействие на свечение бактерий оказывает порошок «Эрго» (8) и хозяйственное мыло (9), минимальное – «Лоск» (6).

Сравнивая эффективность воздействия моющих средств на биолюминесценцию биферментной системы, можно отметить, что в большинстве случаев изменения ЛИ коррелируют с изменениями БИ. Значения ЛИ обычно меньше, чем соответствующие значения БИ, поэтому можно предположить, что доступ к центру светоизлучения клетки компонентов моющих средств затруднен в связи с защитными функциями мембраны. Однако для «мягкобактерицидного» мыла (5) ЛИ больше, чем БИ. Вероятно, это связано с тем, что его компоненты действуют на реакцию биолюминесценции опосредованно, оказывая влияние на метаболизм клетки в целом. По-видимому, нарушается функционирование мембраны клетки (ингибируется транспорт веществ или вообще происходит ее разрушение и гибель клетки), что и приводит к полному ингибированию свечения.

3.2. Поверхностное натяжение моющих средств

Результаты измерений поверхностного натяжения (d) растворов исследованных моющих средств представлены на рис. 2.

Рис. 2. Поверхностное натяжение растворов исследованных моющих средств

Рис. 2. Поверхностное натяжение растворов исследованных моющих средств. Мыло: 1 – «детское»; 2 – турецкого производства; 3 – «Saveguard»; 4 – «витаминизированное» (ф-ка «Свобода»); 5 – «мягкобактерицидное» (ф-ка «Свобода»); 9 – «хозяйственное». Порошки: 6 – «Лоск»; 7 – «Tide»; 8 – «Эрго»

Минимальным значением d характеризуется мыло турецкого производства (2), следовательно, можно предположить, что в сравнении с другими моющими средствами оно содержит большее количество ПАВ. В остальных случаях не наблюдалось больших изменений значений d.

В результате сравнения значений d (рис. 2), ЛИ и БИ (рис. 1) определенной связи между этими величинами не обнаружено, следовательно, эффективность воздействия на биолюминесценцию определяется не содержанием ПАВ, а действием различных специфических добавок, веществ, имеющих бактерицидную или бактериостатическую активность.

Выводы

Исследовано влияние группы моющих средств на две биолюминесцентные системы: светящиеся бактерии Photobacterium phosphoreum и водорастворимую биферментную систему NADH:FMN-оксидоредуктаза-люцифераза.

В результате работы установлена различная ингибирующая способность моющих средств. Показано, что в большинстве случаев биферментная система более чувствительна к действию мыл и порошков, чем бактерии, что связано с защитными функциями «мембран».

Измерены поверхностные натяжения водных растворов моющих средств. Сравнение их с БИ и ЛИ позволило сделать предположение, что ингибирование биолюминесценции происходит не за счет поверхностной активности ПАВ, а за счет воздействия специфических компонентов, входящих в состав моющих средств.

В работе показано, что использование двух методов – биолюминесцентного анализа и измерения поверхностного натяжения – позволяет выявить моющие средства с хорошими мыльными качествами, оказывающие минимальное воздействие на биологические системы.

Работа выполнена при поддержке Красноярского краевого фонда науки, грант № 1М0044, 1999–2000 гг.

 

Рейтинг@Mail.ru