Главная страница «Первого сентября»Главная страница журнала «Биология»Содержание №21/2008

Детские работы

Карина Кочарова ;
Наталья Лысенко

Исследование микробной загрязненности воздуха в помещениях школы

Научно-экспериментальная работа

Окончание. См. № 1819/2008

Экспериментальная часть

Материалы и методы

Приготовление питательных сред

Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5% NaCl, кипятят на слабом огне 10–15 мин для растворения веществ, устанавливают нужный рН раствором NaOH с помощью индикаторных бумажек и снова кипятят 30–40 мин до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначального объема водой и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону добавляют 2% порошка агар-агара. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Среда Лурия-Бертани (ЛБ). 1% бакто-триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCl, 1,8% бакто-агара растворяют в воде, устанавливают рН 7,0 и стерилизуют 20 мин при 120 °С.

Желточно-солевой агар (ЖСА) – 10% NaCl, 10–20% желточной взвеси, 2% агара.

Перед разливом в чашки Петри агаровые среды расплавляют и остужают до 45–50 °С. Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях.

Отбор проб для определения общей обсемененности воздуха школьных помещений проводился седиментационным способом, основанным на механическом оседании микроорганизмов. Открытые чашки Петри со стерильной плотной питательной средой устанавливали горизонтально и экспонировали 10–20 мин в зависимости от предполагаемого загрязнения воздуха. Затем чашки закрывали, переворачивали вверх дном и выдерживали 24 ч при температуре 25–30 °С.

Определение общей обсемененности. На 2–3-й день культивирования просматривали чашки, фиксируя в журнале характер и интенсивность роста, морфологию колоний. Культуральные свойства определяли, изучая характер роста культуры с помощью лупы и под малым увеличением микроскопа. Величину и форму колоний, форму краев и прозрачность изучали в проходящем свете, рассматривая чашки со стороны дна. В отраженном свете (со стороны крышки) определяли характер поверхности колоний, окраску. Консистенцию определяли прикосновением бактериальной петли.

При идентификации бактерий (4-е сутки роста колоний) перечисляли их морфологические признаки: форму, наличие капсулы, жгутиков, окраску по Граму.
При окраске по Граму на мазок воздействуют двумя красителями: основным и дополнительным. Различные микроорганизмы неодинаково относятся к красителям трифенилметановой группы: генцианвиолету, метиловому или кристаллическому фиолетовому. Грамположительные (грам+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, не изменяют приобретенный фиолетовый цвет. Грамотрицательные (грам–) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Приготовление мазков, их окраска по Граму. Исследуемый материал распределяли тонким слоем по поверхности обезжиренного предметного стекла. Мазок высушивали на воздухе, затем предметное стекло с препаратом брали пинцетом за ребра мазком вверх и проводили 2–3 раза над верхней частью пламени горелки. На фиксированный мазок наливали основной краситель и оставляли на 2–3 мин. Во избежание попадания осадка окрашивание вели через фильтровальную бумагу. Сливали краску, убирали фильтровальную бумагу. Мазок заливали на 1–2 мин раствором Люголя, затем раствор сливали, мазок прополаскивали в 96% этиловом спирте до обесцвечивания и промывали стекла в проточной воде. Затем окрашивали фуксином, снова промывали в проточной воде и высушивали фильтровальной бумагой. В результате грам+ бактерии окрашивались в темно-синий цвет, грам– – в красный.
Окрашенные по Граму мазки просматривали под микроскопом, фиксируя морфологию клеток.
Две колонии, подозрительные как стафилококковые, отвили на скошенный агар для дальнейшего исследования. Пробирки с посевом поместили в термостат при 37 °С на 18–20 ч. Затем пересадили колонии на дифференциальную среду – желточно-солевой агар, на котором патогенные стафилококки, например золотистый, способны выделять фермент лецитиназу.

Результаты исследований

Для окончательной идентификации и дифференциации микроорганизмов должны быть выделены чистые культуры, подобраны дифференциально-диагностические среды, позволяющие отличить один вид от другого по ферментативной активности, должны быть изучены культуральные свойства на жидких и плотных средах (на жидких средах отмечают прозрачность, наличие осадка или пленки), использованы биохимические методы (изучение ферментативных активностей и т.п.), изучено взаимодействие с антисыворотками, а в особо трудных случаях используют методы молекулярно-генетического анализа (изучение ДНК).

Из-за отсутствия возможности проведения таких исследований в условиях школы мы ограничились ориентировочным определением микроорганизмов. Мы установили форму и размеры колоний, их цвет и консистенцию. При микроскопических исследованиях шести визуально различных колоний определили форму микроорганизмов (кокки, бациллы, овоиды и т.п.), подвижность, отношение к окраске по Граму, наличие спор и капсул.

Количественные результаты по обнаружению микроорганизмов в разных школьных помещениях представлены в табл.1.

Таблица 1. Общая загрязненность воздуха

Место забора проб

Питательная среда

Бактериальные колонии

Грибные колонии

количество колоний на чашке

среди них разных типов

количество колоний на чашке

среди них разных типов

Класс биологии

МПА

0

0

4

2

Столовая

МПА

0

0

4

3

Туалет

МПА

0

0

1

1

Коридор (после большой перемены)

МПА

2

1

1

1

Класс информатики

МПА

1

1

0

0

Раздевалка

ЛБ

48

6

1

1

Коридор во время перемены

ЛБ

32

5

1

1

Всего типов:

 

 

6

 

5

Морфологическое описание колоний микроорганизмов и очень приблизительное (учитывая вышесказанное) ориентировочное определение микроорганизмов до разных таксономических групп представлено в табл. 2, З.

Таблица 2. Морфологические свойства идентифицируемых бактерий

Морфология колонии

Колония № 1

Колония № 2

Колония № 3

Колония № 4

Колония № 5

Колония № 6

Форма

амебовидная

округлая

круглая

амебовидная

неправильная

округлая

Размер, мм

5

2–4

2–4

~ 5

~ 6

2–4

Цвет

грязно­белый

желтый

розовый

белый, в центре розовый

грязно-серый

розовый, в центре желтое скопление

Край

ровный

ровный

ровный

волнистый

лопастной

ровный

Блеск

есть

есть

есть

нет

нет

есть

Поверхность

гладкая

гладкая

гладкая

морщинистая

морщинистая

морщинистая

Профиль

выпуклый, конический

выпуклый, слегка конич.

выпуклый

плоский

плоский

выпуклый

Рисунок

равномерный

равномерный

равномерный

с правильными складками

со складками

равномерный

Структура

однородная

однородная

однородная

неоднородная

неоднородная

неоднородная

Консистенция

мягкая

мягкая

мягкая

мягкая

плотная

мягкая

Морфология и цитология клеток

Форма

кокки

кокки

кокки

кокки и палочки

палочки

кокки

Расположение клеток

скопления, гроздья

собраны в гроздья

скопления

одиночные, кокки, тетрада

одиночные

скопления

Размер

довольно крупные

очень мелкие

мелкие

мелкие

крупные, длинные

довольно крупные

Наличие эндоспор

нет

нет

нет

возможно

нет

нет

Окраска по Граму

грам+

грам+

грам+

грам+ / грам–

грам–

грам+

Предположительно:

Staphilococcus

Micrococcus

сем. Microсоссасеае

Sarcina

филум Вас-teroidetes

ceм. Microсо-ссасеае

Таблица 3. Морфологические свойства идентифицируемых грибов

Морфология колонии

Колония № 1

Колония № 2

Колония № 3

Колония № 4

Колония № 5

Структура

морщинистая, плотная

складчатая, плотная

воздушная

плотная

плотная

Размер, см

2,5

3

3

1,4

0,5

Цвет

серо-зеленый, по краям белый

зеленый, по краям белый

белый

ярко­белый

желто-зеленый

Профиль

плоский

плоский

плоский

выпуклый, ~ 0,3–0,4 см

выпуклый, 0,4 см

Край

лопастной

лопастной

ровный

волнистый

ровный

Морфология мицелия

Септированный

да

да

нет

нет

да

Наличие спорангиев

нет

нет

да

да

да

Форма конидиеносцев

тип Aspergillus

тип Penicillium

нет

нет

нет

Предположительно

Aspergillus

Penicillium

Мuсоr

пор. Mucorales

кл. Ascomycetes

Всего колоний:

5

3

2

1

1

Выводы: в ходе эксперимента было установлено, что общая загрязненность воздуха в школе не превышает допустимых норм (санитарная норма – не более 50 колоний). Выделенные микроорганизмы лучше росли на среде ЛБ, чем на МПА, хотя последняя считается базовой для посевов микроорганизмов из воздуха. При этом среди бактерий отмечалось явное преобладание грам+ кокковой микрофлоры, наиболее распространенными представителями которой являются члены семейства Micrococcaceae (встречаются повсеместно). Это семейство включает роды Staphilococcus (сапрофиты, патогены, условные патогены) и Micrococcus (в основном сапрофиты), микрококки имеют пигмент от желтого до розового, и именно таких цветов колонии преобладают. В одной из колоний оказалась смешанная культура – палочки и кокки разных цветов, что, возможно, вызвано нарастанием колоний друг на друга. Кокки из этой колонии собраны в группы по 2 и 4, что позволяет предположить их принадлежность к сем. Sarcina, или Streptococcaceae. Еще одна культура с грам– палочками вызвала затруднения при идентификации, т.к. обычные почвенные палочки относятся к классам Bacilli и Clostridium и являются грам+. В филум Bacteroidetes входят грам– палочки, обитающие в почве, воде, на разных растениях, поэтому можно предположить, что наши бактерии из этого филума, но точное их определение затруднительно, хотя скорее всего это сапрофитные формы, занесенные с частицами почвы в раздевалку и коридор, где и были обнаружены.

Патогенной бактериальной микрофлоры не было обнаружено. Пересеянные на дифференциальную среду подозрительные колонии по заключению санитарно-эпидемиологической службы не являются колониями золотистого стафилококка.

При идентификации грибов основным критерием служило строение мицелия и спорангиев, или конидиеносцев. Надо отметить значительное присутствие в воздухе школы спор плесневых грибов, которые являются условно-патогенными и могут вызывать плесневые микозы (аспергиллез, мукороз, пенициллиоз) у людей со слабым иммунитетом. Это предполагает необходимость проветривания классных помещений и более тщательной влажной уборки с применением дезинфицирую-щих средств.

Заключение

Сейчас в развитых странах контролируется микологическое и бактериологическое состояние больниц, жилищ, офисов, общественных зданий, детских учреждений и т.д. Источником самых распространенных опасных плесеней (грибов рода Aspergillus) могут оказаться и сухие цветы или земляная смесь для комнатных растений. Кроме того, количество и состав пыли часто связаны с реконструкцией зданий, работой вентиляционных систем и кондиционеров. В воздухе в местах массовых скоплений людей всегда присутствует некоторое количество патогенных бактерий или их споры. Поэтому наша работа по мониторингу чистоты воздуха в школе очень важна для сохранения здоровья школьников, т.к. своевременное выявление возбудителей и меры по дезинфекции способны предупредить развитие локальных вспышек инфекции.

В перспективе возможны проведение аналогичных проверок микрофлоры воздуха для учета сезонных различий, замеры при отсутствии детей в школе (во время каникул), а также проведение посевов из смывов с различных поверхностей, которые дадут представление о загрязненности предметов, которых дети часто касаются руками (перила, дверные ручки, столы в столовых и т.п.).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Методические рекомендации. Методы бактериологического исследования условно-патогенных микроорганизмов в клинической микробиологии (утв. Минздравом РСФСР 19.12.1991).

2. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. – М.: Изд. центр «Академия», 2006.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. – М.: Мир, 1986.

4. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии. – М.: Изд. центр «Академия», 2005.

5. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология в 3 т. – М.: Мир, 1996.

6. Курсанов Л.И., Наумов Н.А., Красильников Н.В. Определитель низших растений. Т. 3. Грибы. – М.: Советская наука, 1954.

Научные руководители:
В.В. КОРЧАГИНА,
Л.В. КОЗАДАЕВА,
Научный консультант:
Е.С. ЗУБКОВА,
Гимназия № 14, г. Одинцово, Моск. обл.

Рейтинг@Mail.ru